在真核細(xì)胞分裂過(guò)程中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重新建立對(duì)于維持基因組完整性和表觀遺傳信息傳遞至關(guān)重要。DNA復(fù)制一方面破壞母鏈DNA的親本核小體，另一方面新生核小體必須在DNA子鏈上重建。染色質(zhì)組裝因子CAF-1是在進(jìn)化過(guò)程中保守的異源三聚體組蛋白伴侶復(fù)合物，負(fù)責(zé)將新合成的H3-H4組蛋白裝配到子鏈DNA上，完成從頭裝配的核小體組裝的第一步，即形成一個(gè)由DNA纏繞H3-H4四聚體組成的核小體組裝中間態(tài)Tetrasome（四聚小體）。

由于CAF-1與最基本生物學(xué)事件DNA復(fù)制高度耦聯(lián)，因此缺少CAF-1的結(jié)構(gòu)信息制約了科學(xué)家對(duì)核小體從頭裝配機(jī)制的了解。CAF-1復(fù)合物是組蛋白伴侶研究方向中公認(rèn)的難題，因其主要亞基柔性很大、結(jié)合組蛋白構(gòu)象不均一、分子量偏小（復(fù)合物穩(wěn)定核心不到150 kDa），以至于用X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡技術(shù)來(lái)獲得其高分辨率三維結(jié)構(gòu)均充滿挑戰(zhàn)性。自1989年發(fā)現(xiàn)CAF-1至今，國(guó)際上僅報(bào)道了約30?低分辨率的酵母Caf-1復(fù)合物負(fù)染電鏡結(jié)構(gòu)，無(wú)法提供相互作用細(xì)節(jié)，導(dǎo)致其中許多關(guān)鍵問(wèn)題長(zhǎng)期得不到解答。中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所許瑞明課題組長(zhǎng)期深耕于組蛋白伴侶的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究，先后揭示了組蛋白伴侶HJURP/DAXX特異識(shí)別組蛋白變體CENP-A/H3.3的結(jié)構(gòu)機(jī)理（Genes & Development?2011;?Nature?Stuctural?&?Molecular?Biology?2012），解析了Asf1調(diào)控組蛋白乙酰化修飾的分子機(jī)制（Cell?2018），闡明了雙組蛋白伴侶sNASP-ASF1與Hat1乙?；竻f(xié)同傳遞與修飾組蛋白的分子機(jī)理（Genes & Development?2021;?Genes & Development?2022）。課題組經(jīng)過(guò)十多年的摸索與優(yōu)化，最終在CAF-1的結(jié)構(gòu)與功能研究上取得了重要突破。

8月25日，許瑞明課題組聯(lián)合李國(guó)紅、朱冰課題組，在《科學(xué)》（Science）上，在線發(fā)表了題為Structural insights into histone binding and nucleosome assembly by chromatin assembly factor-1的研究長(zhǎng)文，報(bào)道了人源染色質(zhì)組裝因子CAF-1、CAF-1與組蛋白H3-H4及核小體組裝中間態(tài)Di-tetrasome等復(fù)合物一系列近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，揭示了CAF-1結(jié)合組蛋白并介導(dǎo)右手螺旋核小體組裝中間態(tài)形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。?

該研究通過(guò)CAF-1復(fù)合物不同片段組合的大量結(jié)晶條件篩選，解析了人源CAF-1復(fù)合物核心部分3.5?的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)顯示，CAF-1三個(gè)蛋白亞基按1:1:1的方式結(jié)合，p150大亞基猶如一根柔軟的繩子，兩端分別纏繞住球狀的p60亞基和p48小亞基。p150的ED-loop處于無(wú)序狀態(tài)，CAF-1這種靈活的架構(gòu)賦予了它結(jié)合組蛋白的可塑性，方便進(jìn)行組蛋白的裝配。體外生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAF-1核心部分仍具有較強(qiáng)的結(jié)合組蛋白和組裝核小體能力，但缺乏對(duì)其結(jié)合組蛋白與組裝核小體分子機(jī)理的直觀認(rèn)識(shí)。進(jìn)一步，研究通過(guò)長(zhǎng)期的摸索與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了在CAF-1-H3-H4樣品中加入30-bp的DNA片段可改善樣品性質(zhì)，并解析了CAF-1-H3-H4五元復(fù)合物3.5?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)清楚地顯示了一個(gè)CAF-1復(fù)合物結(jié)合一個(gè)H3-H4異源二聚體。CAF-1大亞基p150的ED-loop此時(shí)變得有序，如同一根安全帶將組蛋白H3-H4牢牢綁住。對(duì)ED-loop突變體的體外生化和體內(nèi)DNA復(fù)制偶聯(lián)核小體組裝實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，ED-loop的碳端對(duì)于DNA復(fù)制偶聯(lián)的核小體組裝至關(guān)重要。CAF-1三亞基協(xié)同作用結(jié)合組蛋白H3-H4的模式非常獨(dú)特，p60擋住了H3-H4二聚體進(jìn)一步形成四聚體的位置，解釋了CAF-1無(wú)法直接結(jié)合H3-H4四聚體的原因。此外，30-bp DNA的加入促使部分CAF-1-H3-H4復(fù)合物形成二聚體。研究捕獲到該二聚復(fù)合體4.6?的電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體中兩個(gè)H3-H4二聚體的排列方式與H3-H4四聚體中的排列類似但不完全一樣，說(shuō)明DNA與CAF-1共同參與組蛋白H3-H4四聚體的形成。當(dāng)加入147-bp DNA進(jìn)行組裝時(shí)，研究意外地獲得了CAF-1結(jié)合右手螺旋Di-tetrasome這一核小體組裝中間態(tài)的3.8?的電鏡結(jié)構(gòu)。體外單分子磁鑷實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CAF-1在生理鹽條件下可誘導(dǎo)右手螺旋核小體組裝中間態(tài)的形成。這種與左手螺旋的成熟核小體NCP截然相反的手性，提示在核小體組裝過(guò)程中可能存在保護(hù)性的中間步驟。

該研究厘清了CAF-1結(jié)合何種組蛋白H3-H4聚合狀態(tài)的長(zhǎng)期爭(zhēng)議，捕獲到CAF-1促進(jìn)組蛋白H3-H4二聚體四聚化的中間態(tài)構(gòu)象，并首次發(fā)現(xiàn)了CAF-1誘導(dǎo)右手螺旋核小體組裝中間態(tài)的形成，提示了手性可能是調(diào)控核小體裝配重要手段之一，刷新了人們對(duì)核小體裝配過(guò)程的認(rèn)知。

研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)和中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)等的資助，并獲得上海同步輻射光源以及生物物理所生物成像中心和蛋白質(zhì)科學(xué)平臺(tái)的技術(shù)支持。

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人源CAF-1結(jié)合組蛋白H3-H4并介導(dǎo)核小體組裝的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)