7月11日，中國科學(xué)院生物物理研究所高璞、高光俠、張立國合作團(tuán)隊(duì)，在《細(xì)胞》（Cell）上發(fā)表了題為Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1的研究論文。該研究報(bào)道了EBV（Epstein-Barr Virus）關(guān)鍵致癌蛋白潛伏期膜蛋白1（LMP1）自組裝和組成性激活的分子基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了LMP1以全新且與此前猜測完全不同的機(jī)制進(jìn)行寡聚自組裝，并通過巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號的活化。該研究發(fā)現(xiàn)的新機(jī)制和新界面有望助力LMP1靶向干預(yù)策略的開發(fā)工作。

EBV是一種人類皰疹病毒，也是首個被報(bào)道的人類腫瘤病毒。雖然EBV通常不產(chǎn)生嚴(yán)重癥狀，但EBV感染有幾率導(dǎo)致多種淋巴癌和上皮細(xì)胞癌。

LMP1是EBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白。1985年，Elliott Kieff課題組首次報(bào)道LMP1單一蛋白表達(dá)即能夠誘發(fā)B細(xì)胞的永生化，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)LMP1通過模擬CD40信號參與B細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖和早期癌變。與CD40不同，LMP1信號的激活不依賴任何配體，且LMP1介導(dǎo)的信號強(qiáng)度強(qiáng)于CD40。除了介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化，LMP1還參與調(diào)控多種重要生命活動，包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子和趨化因子分泌、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞互作、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。鑒于LMP1與EBV致病的高度關(guān)聯(lián)性，以及LMP1在EBV相關(guān)惡性腫瘤中的廣泛表達(dá)和分布，LMP1被認(rèn)為是EBV陽性腫瘤鑒別診斷和靶向治療的理想靶點(diǎn)。盡管目前對LMP1介導(dǎo)的下游功能已有較多認(rèn)識，但作為產(chǎn)生多樣性功能的核心前提即LMP1如何實(shí)現(xiàn)配體不依賴的組裝和激活仍是難題，也是LMP1靶向干預(yù)策略開發(fā)的阻礙。

該研究利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像，發(fā)現(xiàn)LMP1在生理表達(dá)水平下會在膜上呈現(xiàn)出明顯的聚集形態(tài)。進(jìn)一步的超分辨成像表明，LMP1的聚集是寬度較為固定但長度不均一的細(xì)條狀結(jié)構(gòu)。這表明LMP1可在膜上組裝成有序的聚集體，但其分子層面的細(xì)節(jié)尚不清楚。為回答這一問題，科研人員計(jì)劃解析LMP1在不同組裝狀態(tài)下的精細(xì)結(jié)構(gòu)。然而，這一目標(biāo)具有挑戰(zhàn)性，原因在于性質(zhì)良好的LMP1蛋白較難大量制備，LMP1核心跨膜區(qū)僅~20 KDa且?guī)缀鯚o可識別的穩(wěn)定水溶區(qū)。

經(jīng)過大量嘗試，該研究解決了LMP1難表達(dá)、難純化的問題。生化分析提示LMP1在溶液存在不同聚集狀態(tài)。為輔助結(jié)構(gòu)解析，該研究進(jìn)一步開展了系統(tǒng)性LMP1抗體篩選，獲得了能夠穩(wěn)定結(jié)合LMP1跨膜區(qū)的鼠源單抗。研究通過抗體輔助策略解析了LMP1兩種聚集態(tài)結(jié)構(gòu)——軸對稱二聚體和纖維狀高聚體。LMP1單體以全新的方式進(jìn)行跨膜區(qū)折疊，進(jìn)而通過反向平行疊合形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)；LMP1二聚體是其進(jìn)行更高級組裝的基本單元，多個二聚體以并行的方式自組裝形成纖維狀高聚結(jié)構(gòu)。這些高分辨率的結(jié)構(gòu)信息符合活細(xì)胞成像所觀測到的獨(dú)特聚集形態(tài)，從而在不同分辨率尺度上揭示了LMP1的膜上聚集機(jī)制。

由于目前PDB數(shù)據(jù)庫中尚無任何LMP1的同源結(jié)構(gòu)，而LMP1多種狀態(tài)的真實(shí)結(jié)構(gòu)均與通過AlphaFold2/3等軟件預(yù)測的結(jié)果不同。同時，這種差異體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)折疊的差異，并預(yù)測模型中的基本拓?fù)鋵W(xué)走向亦是錯誤的。這提示在沒有同源結(jié)構(gòu)訓(xùn)練的情況下，對于預(yù)測結(jié)構(gòu)的使用需格外謹(jǐn)慎。從另一個角度來說，該研究獲得的LMP1多種聚集狀態(tài)的真實(shí)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)預(yù)測訓(xùn)練提供了全新且獨(dú)立的折疊方式及組裝模式。

為進(jìn)一步明確LMP1的功能形式，該工作對二聚體和寡聚體界面分別進(jìn)行系統(tǒng)突變，發(fā)現(xiàn)其均會破壞LMP1在活細(xì)胞中的膜聚集形態(tài)，且均能阻斷下游信號通路的活化。這證明了LMP1分子間互作的重要性，并明確了LMP1的寡聚纖維結(jié)構(gòu)才是其真正的激活狀態(tài)。超分辨成像結(jié)果表明，LMP1在膜上的自發(fā)形成的纖維狀聚集包含幾十至數(shù)百個LMP1二聚體單元。LMP1的這種聚集在很低蛋白水平下即可發(fā)生且隨著LMP1含量增加，同時，多聚體的數(shù)量、強(qiáng)度和長度均顯著增長。這是首次在較低表達(dá)水平下系統(tǒng)性觀察到LMP1在膜上的超分辨動態(tài)聚集和組裝。

作為LMP1的功能相關(guān)蛋白，宿主膜受體CD40的激活需依賴其配體介導(dǎo)的三聚體組裝；LMP1和CD40共同的下游信號因子TRAF蛋白以三聚體形式發(fā)揮功能。因此，長期以來，普遍推測LMP1應(yīng)是采用三聚體的方式來組裝，這樣才能更好地與下游因子進(jìn)行銜接。然而，LMP1是以二聚體為單元進(jìn)行并行方式的纖維自組裝。那么，LMP1是如何有效協(xié)調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)？分析發(fā)現(xiàn)，二聚體單元中的兩個LMP1的C端，可以和鄰近二聚體中一個LMP1的C端，在空間上呈現(xiàn)近似等邊三角形的巧妙排列。由于C端延伸的水溶區(qū)負(fù)責(zé)招募下游因子，因而這種纖維自組裝方式結(jié)構(gòu)上等價于多個LMP1“三聚體”平行密集排列，從而能夠比CD40更高效招募下游因子和進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究證實(shí)，如果將CD40 負(fù)責(zé)下游因子招募的C端水溶區(qū)連接到LMP1的跨膜區(qū)上，那么這種嵌合體蛋白的信號激活能力強(qiáng)于原始的CD40。同時，研究通過生化手段在體外重組LMP1與TRAF復(fù)合體，利用電鏡直接觀察到LMP1的纖維聚集可以同時招募多對TRAF三聚體。LMP1這種多位點(diǎn)且組成性的下游蛋白招募、激活方式，促進(jìn)了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度，并有效維系了持續(xù)的增殖、癌變信號。

研究工作得到國家自然科學(xué)基金委員會、科學(xué)技術(shù)部、中國科學(xué)院以及北京市等的資助。相關(guān)實(shí)驗(yàn)得到生物物理所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺的支持。

論文鏈接

CD40與LMP1的不同激活機(jī)制