細(xì)胞焦亡是由gasdermin（GSDM）家族蛋白介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體抵御病原感染、清除變異或有害細(xì)胞等過(guò)程中發(fā)揮作用。作為細(xì)胞焦亡的直接執(zhí)行者，GSDM蛋白備受關(guān)注。哺乳動(dòng)物的GSDM蛋白具有保守的自抑制雙結(jié)構(gòu)域特征，發(fā)揮抑制作用的C端結(jié)構(gòu)域通過(guò)與N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)相互作用，將全長(zhǎng)蛋白鎖定在非激活態(tài)。GSDM蛋白的激活需要上游專門的蛋白酶特異性切割，釋放N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域并在細(xì)胞膜上寡聚打孔，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。GSDM是一類在進(jìn)化上保守的膜打孔蛋白，存在于多種細(xì)菌、真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物以及所有的脊椎動(dòng)物。盡管在細(xì)菌和真菌等低等生物中發(fā)現(xiàn)的GSDM蛋白與哺乳動(dòng)物的GSDM蛋白的序列差異顯著，且其C端的結(jié)構(gòu)元件普遍短小，但均采用典型的自抑制方式維持在非激活態(tài)，需要特定的蛋白酶切割來(lái)釋放保守的膜打孔結(jié)構(gòu)域，引起焦亡樣的裂解性細(xì)胞死亡。因此，除蛋白酶切割激活以外，GSDM蛋白是否存在其他不依賴酶切的激活機(jī)制以及這一機(jī)制如何介導(dǎo)GSDM蛋白執(zhí)行細(xì)胞焦亡的功能，有待進(jìn)一步研究。

4月25日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所丁璟珒研究組與北京生命科學(xué)研究所邵峰團(tuán)隊(duì)合作，在《科學(xué)》（Science）上在線發(fā)表了題為Cleavage-independent activation of ancient eukaryotic gasdermins and structural mechanisms的合作研究論文，揭示了兩種來(lái)源于低等真核生物的GSDM蛋白通過(guò)非蛋白酶切割的新穎方式激活的分子機(jī)制。

該研究通過(guò)序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，最原始的多細(xì)胞生物絲盤蟲的基因組編碼了一個(gè)只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM同源蛋白（TrichoGSDM）。研究通過(guò)重組表達(dá)和純化鑒定發(fā)現(xiàn)，TrichoGSDM蛋白同時(shí)存在單體和二聚體兩種形式。其中，單體蛋白具有在脂質(zhì)體上打孔的活性，而二聚體則不能上膜打孔。進(jìn)而，研究解析TrichoGSDM二聚體高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，TrichoGSDM二聚體是由兩個(gè)單體蛋白通過(guò)三對(duì)分子間二硫鍵交聯(lián)而成。研究顯示，在體外利用還原劑處理TrichoGSDM二聚體或者突變參與二硫鍵形成的Cys，均可以獲得均一的單體蛋白，并展示出強(qiáng)烈的膜打孔活性，這表明二硫鍵連接的二聚體代表TrichoGSDM蛋白的非激活狀態(tài)，以及二聚體向還原態(tài)的單體轉(zhuǎn)換可能是TrichoGSDM蛋白潛在的激活機(jī)制。細(xì)胞質(zhì)中的谷胱甘肽（GSH）和硫氧還蛋白（TRX）是兩種抗氧化系統(tǒng)，可以清除胞質(zhì)中有害的活性氧或者蛋白質(zhì)錯(cuò)誤氧化形成的二硫鍵，并維持胞質(zhì)的還原環(huán)境。進(jìn)一步，該研究利用胞質(zhì)生理濃度的GSH或絲盤蟲的TRX蛋白處理TrichoGSDM二聚體，可將二聚體還原、釋放單體的膜打孔活性，在細(xì)菌中誘導(dǎo)表達(dá)TrichoGSDM具有和哺乳動(dòng)物GSDM蛋白N端結(jié)構(gòu)域相似的抑菌活性，說(shuō)明細(xì)菌胞質(zhì)的還原環(huán)境利于TrichoGSDM維持在活化的單體狀態(tài)，通過(guò)在細(xì)菌膜上打孔抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。進(jìn)而，研究解析了TrichoGSDM在脂質(zhì)體膜上形成的分子孔道高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了TrichoGSDM由44個(gè)單體形成了目前已知的真核生物最大的GSDM孔道。研究通過(guò)結(jié)構(gòu)分析揭示了TrichoGSDM識(shí)別酸性磷脂、發(fā)生構(gòu)象變化并寡聚組裝成孔的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上述研究闡明了TrichoGSDM從分子間二硫鍵介導(dǎo)的二聚體自抑制狀態(tài)，通過(guò)還原二硫鍵活化成具有打孔活性的單體狀態(tài)，并進(jìn)一步在膜上寡聚打孔介導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。這種新穎的激活機(jī)制首次在GSDM蛋白中發(fā)現(xiàn)。

TrichoGSDM的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研人員繼續(xù)探尋只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白的興趣。研究在絲狀真菌粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的融合致死基因rcd-1，在不同菌株中的等位基因可編碼RCD-1-1和RCD-1-2兩種同源蛋白。當(dāng)不同菌株發(fā)生細(xì)胞融合時(shí)，兩種RCD-1蛋白介導(dǎo)同種異體識(shí)別引發(fā)的細(xì)胞死亡。研究通過(guò)解析RCD-1-1和RCD-1-2的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩種RCD-1蛋白與哺乳動(dòng)物GSDM的膜打孔結(jié)構(gòu)域具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但二者缺少發(fā)揮自抑制功能的結(jié)構(gòu)元件。單獨(dú)的RCD-1-1或RCD-1-2在溶液中呈現(xiàn)單體狀態(tài)，通過(guò)識(shí)別酸性磷脂結(jié)合在脂質(zhì)體膜上卻無(wú)法寡聚打孔，因而無(wú)細(xì)胞毒性。然而，兩種RCD-1蛋白在大腸桿菌、釀酒酵母或HeLa細(xì)胞等多種細(xì)胞系統(tǒng)中共表達(dá)時(shí)，會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的裂解性細(xì)胞死亡。研究通過(guò)解析共孵育的RCD-1-1和RCD-1-2蛋白在脂質(zhì)體膜上形成的分子孔道冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白通過(guò)交替排布的異源寡聚組裝方式形成已知的最小GSDM孔道。研究分析RCD-1分子孔道中兩種蛋白的作用方式發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)RCD-1-1分子均與兩側(cè)相鄰的RCD-1-2分子相互作用，但兩側(cè)的互作方式不等效。也就是說(shuō)，擁有更強(qiáng)分子間極性作用的一側(cè)主導(dǎo)RCD-1異源二聚體的形成，而另一側(cè)的分子間相互作用驅(qū)動(dòng)以異源二聚體為單元進(jìn)一步寡聚成孔。將RCD-1-1和RCD-1-2蛋白與脂質(zhì)體共孵育，或分別結(jié)合脂質(zhì)體后再進(jìn)行共孵育，均可以通過(guò)兩種蛋白的分子間識(shí)別激活在脂質(zhì)體膜上的打孔活性，而將異源二聚體識(shí)別界面的關(guān)鍵殘基突變，在分別表達(dá)兩種蛋白的不同交配型酵母細(xì)胞融合或不同粗糙脈孢菌菌株的孢子融合時(shí)，均阻斷了RCD-1蛋白的分子間識(shí)別，因而不能激活膜打孔活性并引起裂解性細(xì)胞死亡。上述工作揭示了具有膜結(jié)合特性的RCD-1蛋白單獨(dú)存在時(shí)處在未激活的靜息狀態(tài)，細(xì)胞融合導(dǎo)致兩種蛋白相遇，通過(guò)分子間特異性識(shí)別來(lái)激活異源二聚體組裝，并進(jìn)一步在細(xì)胞膜上寡聚成孔，執(zhí)行細(xì)胞死亡的功能。

上述成果打破了GSDM蛋白需要蛋白酶切割打開自抑制以及激活膜打孔活性的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，揭示了低等真核生物中兩類只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白，分別通過(guò)氧化還原調(diào)控或配對(duì)的分子間相互作用來(lái)釋放膜打孔活性的全新激活機(jī)制，拓展了對(duì)于GSDM蛋白進(jìn)化和功能多樣性的機(jī)制認(rèn)知。多種不同的激活機(jī)制表明，GSDM蛋白可以響應(yīng)更廣泛的生物學(xué)信號(hào)，參與更豐富的生命活動(dòng)過(guò)程。同時(shí)，這種不依賴酶切的GSDM蛋白具有被開發(fā)為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡新型工具的潛力，并有望助力細(xì)胞焦亡相關(guān)的基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化研究。

研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、科學(xué)技術(shù)部、中國(guó)科學(xué)院和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院等的支持。

論文鏈接

低等真核生物絲盤蟲和粗糙脈孢菌編碼只含有膜打孔結(jié)構(gòu)域的GSDM蛋白，通過(guò)非蛋白酶切割的新穎方式激活膜打孔活性，執(zhí)行細(xì)胞死亡的功能。